该试剂中含有WST-8,在电子载体1-Methoxy PMS的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(Formazan dye)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
用途:广泛用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。
特点:对细胞毒性小,可以多次测定选取最佳测定时间;检测迅速;灵敏度高。
实验步骤:
1.种板数:根据你摸索的,或者查阅文献确定你需要的种板浓度,根据种板浓度对细胞悬液进行稀释,通常细胞增殖实验每孔加入约1000-2000个细胞100ul,细胞毒性实验每孔加入约5000~10000个细胞100ul(具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小,细胞增殖速度的快慢等决定)。
2.种板:以96孔板为例,96孔板横向是1-12的数字,纵向是A-H,可做多个实验组,每组设置4-6个复孔,同时设置空白组,最边缘孔加入PBS缓冲液减少蒸发带来的影响,然后将细胞置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中培养12-24 h。
3.加药及加药后孵育时间:观察细胞细胞贴壁良好,吸出各孔培养基,实验组加入含不同浓度药物的培养基,空白组加入不含药物培养基,然后将96孔板在37℃ 5% CO2空气的细胞培养箱中孵育适当时间,根据不同实验细胞需求选择适当的孵育条件和时间。
4.加入CCK-8:两种方法,每孔直接加入10ul的CCK-8溶液,或者配置成含10%CCK-8溶液的培养基以换液的形式加入,注意加入过程中避免产生气泡,可以将枪头浸入培养液中缓慢加入。
5.加入CCK-8后孵育时间:将加完CCK-8的培养板放入37°C 5%CO2 培养箱中孵育1-4h,CCK-8试剂加入后孵育时间也需要自己摸索,随着时间的增加,OD值就会增大。可以在0.5h、1.0h、2.0h分别测OD值,把OD值控制在1.0左右。
6.测OD值:将96孔板取出,酶标仪检测各孔在450nm波长处的OD值,分析处理数据,绘制增殖曲线。
7.结果分析:
A.细胞存活率:将各测试孔的OD值减去本底OD值(空白组)各重复孔的OD值取平均数±SD。
细胞存活率% =(加药细胞OD/对照细胞OD)×100%。
B. 求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)。
*以上内容来自网络
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