一、模板
1. 模板降解
1)尽量选择新鲜提取的模板进行 PCR 扩增,通过凝胶电泳检测模板的完整性,若降解严重需要重新制备模板;
2)模板避免反复冻融。
2. 模板中含有抑制 DNA 聚合酶活性的抑制剂
1)采用离心柱法提取核酸,纯化模板,消除抑制剂的干扰;
2)适当减少模板量,采用梯度稀释摸索最佳模板量;
3)选用抗逆性强的 DNA 聚合酶。
3. 模板量太低
1)适当增加模板量;
2)模板为 cDNA 时,选用目的基因表达量高的组织提取高质量 RNA 并选用基因克隆专用的反转录试剂盒得到的 cDNA 作为模板;
3)选用灵敏度高的 DNA 聚合酶。
4. 高 GC, 复杂模板
1)使用 PCR 添加剂(比如 DMSO,甜菜碱)或 GC enhancer,促进高 GC,复杂序列模板双链解离从而有利于引物退火和序列延伸;
2)增加变性时间或温度,使 DNA 双链彻底解离;
3)选用适用于高 GC,复杂模板扩增的 DNA 聚合酶。
5. 长片段
1)确保模板的完整性;
2)选择适用于长片段扩增的 Taq DNA 聚合酶或者超强高保真 DNA 聚合酶;
3)在试剂盒说明书建议的延伸速度基础上适当延长延伸时间;
4)采用抑制热交错 PCR(Suppression Thermo-Interlaced PCR, STI PCR)策略。
二、引物
1. 引物降解
1)重新合成高质量引物,少量分装保存,防止多次冻融,避免长期置于冰箱冷藏部分。
2. 引物设计不合理
1)建议使用引物设计软件(比如 Primer premier 6, Oligo 7 等)设计并选取评分较高的引物;
2)确保引物和模板结合的特异性。
三、DNA 聚合酶及其他反应组分
1. DNA 聚合酶选择不合适
1)根据实验目的选择合适的 DNA 聚合酶,比如分子克隆实验中涉及到序列的高保真扩增,需要选择一款针对不同类型序列具有普适性的高保真酶。
2. DNA 聚合酶活力下降
1)检查试剂是否过期,按照说明书要求合理保存试剂。
3. 反应缓冲液体系与目的基因不匹配
1)不同目的 PCR 反应要求反应缓冲液中的镁离子、钾离子、铵离子、化学添加剂等成分浓度是不一样的,建议使用试剂盒中优化好的缓冲液体系。
四、反应条件
1. 退火温度不合适,影响引物与模板特异结合
1)使用引物设计软件建议的退火温度,退火温度一般比引物的 Tm 值低 5 ℃;
2)不同的试剂盐离子浓度不同,最佳的退火温度可能存在差异,建议以软件建议退火温度为中心设置温度梯度,来获得最佳退火温度;
3)设置降落 PCR(Step-down)反应程序。
2. 其他反应条件不合适
1)不同的 DNA 聚合酶试剂最佳反应条件是有差别的,选用试剂说明书建议的变性温度和时间,退火时间,延伸温度和速度,循环数。
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